在细胞生物学研究中，
24孔板0.4µm细胞培养小室无菌是构建细胞共培养体系、研究细胞迁移与侵袭能力的经典工具。该孔径既能有效分隔上下室细胞，允许信号分子自由流通，又能阻止细胞随意穿越，是模拟体内生理屏障的理想模型。然而，这一精密实验的成功与否，高度依赖于严格的无菌操作流程。本文将系统阐述从实验准备到细胞接种的全过程无菌操作规范，旨在为科研工作者提供一套标准化、可复制的操作指南。
一、实验准备与环境灭菌：构筑无菌防线
在进行任何细胞操作之前，构建一个洁净的无菌环境是首要前提。这不仅关乎实验结果的准确性，更直接决定了细胞能否存活。
1.超净工作台预处理：实验开始前，需提前打开超净工作台的紫外灯，照射台面及内部物品30分钟以上，以杀灭空气中的微生物。照射结束后，关闭紫外灯，开启风机运行10-15分钟，排出残留的臭氧。操作前，需用75%酒精棉球擦拭台面及双手。
2.耗材与试剂消毒：将预热的培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶等试剂瓶外表面用75%酒精擦拭后放入超净台。所有接触细胞的耗材，如移液器吸头、离心管等，必须确保无菌。操作过程中应始终在酒精灯火焰旁的无菌区域内进行，打开的瓶口需短暂过火灭菌。
二、小室预处理与膜润湿：打通物质交换通道
0.4µm的微孔膜是实验的核心，其预处理直接关系到后续细胞能否正常贴壁生长及信号分子的通透性。
1.膜润湿操作：将Transwell小室小心放入24孔板的对应孔位中。使用无菌移液器，向上室（小室内）缓慢加入100-200µL的无血清培养基或PBS缓冲液。加入液体时，枪头应尽量贴近小室壁，避免液体直接冲击膜面产生气泡。这一步骤的目的是利用液体浸润膜孔，排出膜内的空气，确保膜全部水化。若膜上残留气泡，会阻碍营养物质通过，导致局部细胞死亡。
2.气泡排除技巧：加入液体后，仔细观察膜表面。若发现气泡附着，可轻轻倾斜小室，或用枪头在膜边缘轻轻引导，使气泡汇集后排出。确认膜面湿润均匀且无气泡后，将小室置于37℃培养箱中平衡至少30分钟，或直接进行下一步操作。
三、细胞悬液制备与无菌接种：精准投放生命种子
细胞接种是无菌操作中最关键的环节，任何疏忽都可能导致微生物污染，前功尽弃。
1.细胞消化与重悬：取对数生长期的细胞，弃去旧培养基，用PBS清洗后加入适量胰蛋白酶进行消化。待细胞变圆脱落时，加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打制成单细胞悬液。将细胞悬液转移至无菌离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清。
2.细胞计数与稀释：用适量的无血清培养基（用于迁移实验）或培养基重悬细胞沉淀。使用细胞计数板或自动计数仪进行计数，并根据实验需求调整细胞密度至适宜浓度（通常为1×10^5至5×10^5 cells/mL）。
3.无菌接种：用无菌移液器吸取适量细胞悬液（通常为100-200µL），缓慢加入Transwell小室的上室中。加入时动作要轻柔，避免产生气泡或液体溅出。接种完成后，可轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布在膜上。
4.下室培养基添加：向24孔板的下室（即小室下方的孔内）加入500-600µL的培养基（或含特定趋化因子的培养基）。添加时需注意，下室液面高度应略低于小室内的液面，或与之持平，切勿过高导致液体渗入上室，破坏浓度梯度。
四、培养观察与终点处理：守护数据完整性
细胞接种完成后，需将培养板放入37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。培养期间，应尽量避免频繁取出观察，以减少温度波动和污染风险。通常培养12-48小时后，可根据实验设计进行固定、染色和细胞计数。
总结
24孔板0.4µm细胞培养小室无菌操作流程，本质上是一场与微生物污染的博弈。从环境灭菌到膜润湿，再到细胞接种，每一个步骤都要求操作者具备高度的无菌意识和娴熟的技巧。只有严格遵守上述流程，才能确保实验数据的真实可靠，为生命科学研究提供坚实的数据支撑。
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更新时间：2026-02-10 
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